【摘要】目的 联合单层培养和三维培养方法，探讨软骨细胞培养的理想方法。方法 第一步先将软骨细胞进行常规单层培养扩增,第二步再将单层培养第4代软骨细胞包裹于海藻酸钠水凝胶中进行三维培养。通过倒置显微镜定期观察软骨细胞的形态变化；应用锥虫蓝染色和LIVE/DEADR ○ Kit试剂盒检测软骨细胞的活力和细胞增殖；通过组织化学甲苯胺蓝特异性染色检测细胞外基质的形成变化。结果 单层培养3代之前软骨细胞能保持正常的组织学形态,三维培养能使去分化的4代软骨细胞逐渐恢复并持续维持正常的软骨组织表型。单层培养的软骨细胞的4代以前的细胞活力保持在90%左右,第4代以后开始下降；三维培养的软骨细胞活力都保持在90%以上。在细胞增殖率方面,单层培养6代软骨细胞（28 d）总的倍增率是同期三维培养的44倍。单层培养的软骨细胞4代之后,其细胞外基质平均染色强度降低（P〈0.05）；三维培养21 d和28 d后的软骨细胞外基质表达强度与7 d时相比升高,差异有统计学意义（P〈0.05）。结论 先通过单层培养使软骨细胞适宜扩增,然后将其转入水凝胶中三维培养恢复退变的软骨组织表型,可达到既扩增自体软骨细胞数目同时又保持正常组织表型的目的,两步培养法是一种较理想的软骨细胞培养方法。