针对人NeuroD基因RNA干扰慢病毒载体的构建及鉴定
【作者】
王洋
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高莉
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卜海激
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陈颖
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朱明华
【关键词】
慢病毒
NeuroD基因
RNA干
【摘要】目的构建并鉴定人神经源性分化蛋白基因(NeuroD)RNA干扰慢病毒表达载体。方法根据已公布的NeuroD基因序列(GenBank:NM-002500),设计并合成4对shRNA(NeuroD1~D4),与载体pcDNAr^TM6.2-GW/EmGFP-miR连接,构建pcDNA”6.2-GW/EmGFP—miR-NeuroD表达载体,转化入感受态细胞DH5a;real—timePCR技术检测pcDNA^TM6.2-Gw/EmGFP_miR_NeuroD表达载体对293T细胞内靶基因的干扰效果。将筛选出的干扰载体pcDNA”6.2-Gw/EmG—FP-miR—NeuroDl与慢病毒载体pLenti6.3/V5-DEST经酶切后连接,构建慢病毒表达载体pLenti6.3-EGFP-Neur0D1-miR。用构建的慢病毒表达载体和包装质粒(PackagingMix)共转染293T细胞,包装病毒,收集病毒原液,超速离心浓缩,并测定滴度。采用PCR法对重组载体进行鉴定,利用绿色荧光蛋白作为报告基因,对病毒滴度和感染效率进行检测。结果成功构建针对靶基因的4个干扰质粒,测序结果表明,4个pcDNA^TM6.2-GW/EmGFP-miR—NeuroD表达载体序列与参考序列一致,real—timePCR检测显示以pcDNA^TM6.2-GW/EmGFP—miR-NeuroDl的沉默效应最佳(P〈0.01)。将重组获得的慢病毒表达载体pLenti6.3-EGFP—NeuroDl-miR转染至293T细胞株,酶切鉴定及PCR结果与病毒载体的预期一致,病毒滴度达1.18×10^8ifu/mL。结论成功构建、筛选了针对人NeuroD基因的RNA干扰慢病毒表达载体。
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