融合蛋白AnxBl-MLT的表达、纯化及其对肝癌细胞SMMC7721和
【作者】
王玉招
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颜宏利
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唐冠楠
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林恒荣
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章意亮
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孙树汉
【关键词】
膜联蛋白B1
蜂毒素
细胞增
【摘要】目的以膜联蛋白B1(AnxBl)为导向分子,与蜂毒素(MLT)基因融合,制备AnxBl一MLT融合蛋白,探讨其对磷脂酰丝氨酸脂质体的结合活性及对肝癌细胞SMMC7721和HepG2增殖的抑制作用。方法利用重叠延伸PCR技术构建AnxBl和MLT的融合基因AnxBl-MLT,克隆至原核表达载体pGEX-5T,转化至宿主菌K802,用异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)诱导AnxBl-MLT融合蛋白表达,优化表达条件,用谷胱甘肽一孓转移酶(GST)亲和色谱纯化柱纯化融合蛋白。采用磷脂结合实验验证AnxBl-MLT融合蛋白的钙依赖性磷脂结合活性,采用CCK-8方法分别检测AnxBl-MLT融合蛋白对肝癌细胞系SMMC7721和HepG2细胞增殖的影响。结果AnxBl-MLT融合蛋白在宿主菌K802中能够表达,在菌液生长至D600为0.6时,加入诱导剂IPTG至终浓度0.2mmol/L,低温(22~24℃)诱导表达4h,可使蛋白表达量较高且在上清有表达。通过GST亲和色谱纯化柱纯化融合蛋白,SDS-PAGE结果显示在63000处可见单一目的条带,纯度〉95%。AnxBl-MLT融合蛋白保留了AnxBl的钙依赖性磷脂结合活性,并能显著抑制肝癌细胞系SMMC7721和HepG2的增殖。结论成功制备了AnxBl-MLT融合蛋白,该融合蛋白具有AnxBl的钙依赖性磷脂结合活性,可抑制肝癌细胞SMMC7721和HepG2的增殖,为进一步利用动物实验研究AnxBl-MLT的抗肿瘤效果奠定了基础。
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