【摘要】目的 应用RNA干扰技术构建大鼠肌球蛋白重链14(MYH14)基因重组慢病毒载体并鉴定.方法 根据MYH14 mRNA序列设计合成单链引物形成双链寡核苷酸序列,连接入经AgeⅠ和BamHⅠ双酶切线性化的GV298慢病毒质粒载体中,菌液经PCR鉴定并测序验证.取测序正确的菌液提取质粒转染大鼠施万细胞RSC96,利用免疫荧光法观察转染效率,蛋白质印迹法筛选有效敲低MYH14的shRNA质粒,CCK-8法检测转染后RSC96细胞的活力.结果 合成3对MYH14-shRNA序列并将其克隆到GV298载体中,构建了重组质粒MYH14-shRNA1、2、3,经菌液PCR鉴定和测序筛选出测序正确的载体MYH14-shRNA1和MYH14-shRNA2.免疫荧光检测结果显示转染72 h时RSC96细胞荧光表达最强;蛋白质印迹法检测结果显示,与阴性对照(scramble序列)组相比,MYH14-shRNA2转染后RSC96细胞中MYH14蛋白的表达水平降低(0.57±0.15 vs 1.11±0.06,P<0.01),而MYH14-shRNA1转染后MYH14蛋白表达水平差异无统计学意义(P>0.05).MYH14-shRNA2转染RSC96细胞24 h后的细胞活力与阴性对照组相比差异无统计学意义(1.09±0.16 vs 1.00±0.15,P>0.05).结论 成功构建大鼠MYH14基因重组慢病毒干扰载体,该载体能有效下调RSC96细胞中MYH14的表达.